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超液相色譜法測定雞組織中二硝托胺及其代謝產(chǎn)物殘留量
更新時間:2017-05-12   點擊次數(shù):2072次

二硝托胺因其毒性小,防治球蟲效果好而得到普遍應(yīng)用,但長期高濃度使用會造成藥物殘留,對人體健康造     害我  農(nóng) 業(yè) 235號公告中規(guī)定二硝托胺的zui大殘留*以親體和代謝產(chǎn)物(3-Amino-5-nitro-o-toluamide,ANOT)總量計,雞肉和雞肝中分別為30006000!g/kg目前尚缺乏相應(yīng)的殘留分析物標(biāo)準(zhǔn)方法,因此有必要開展測定雞組織中二硝托胺和ANOT殘留量的分析方法研究。

實驗部分

21儀器與試劑

Waters超液    ( Waters ,配二極管陣列檢測器;AcquityBHEC18  (100mm×21mm17!m) ;固相萃取儀(美國Supelco公司) ;HLB小柱(3mL60mg,Waters公司) ;Sigma離心機;Ultra-TyrraxT25型勻質(zhì)器(德國)。

二硝托胺和ANOT標(biāo)準(zhǔn)品(DrEhrenstorfer公司) ;甲醇和乙腈(色譜純,Merck公司) ;甲酸(色譜純,Tedia公司) ;KH2PO4K2HPO4·3HO2(分析純,上?;瘜W(xué)試劑公司) ;磷酸鹽緩沖液(pH6040)。

22色譜分離條件

流動相:A01%甲酸,B為乙腈。梯度洗脫:010min,80%A;1040min,80%30%A;4050min,30%A;5051min30%80%A;5170min80%A。流速02mL/min,進(jìn)樣量10!L,檢測波長317nm;柱溫30°C。

23樣品處理

準(zhǔn)確稱取2g試料于50mL離心管中,在雞肉和雞肝中分別加入pH70pH40的磷酸鹽緩沖液10mL,以10000r/min速度勻質(zhì)1min,再以8000r/min離心5min,收集上清液;在殘渣中再加入10mL磷酸鹽緩沖液,同樣步驟操作后合并上清液;4mL上清液調(diào)至pH70,再以8000r/min離心5min,上清液加入到已經(jīng)被3mL甲醇和3mL水活化的HLB小柱中,待凈化液液面到達(dá)柱吸附層表面時加入3mL水淋洗,抽干柱子,用4mL01%甲酸-乙腈(8020V/V)洗脫,收集洗脫液,過022!m濾膜,供LC分析。

3結(jié)果與討論

31色譜條件的建立

210800nm范圍內(nèi)對二硝托胺和ANOT的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行掃描(1) ,二硝托胺存在兩個zui大1二硝托胺(a)ANOT(b)光譜分別在21603008nm;ANOT至少存在兩個zui大吸收峰,分別為31745269nm??紤]到ANOT的靈敏度低于二硝托胺,為盡量提高ANOT的靈敏度,避免干擾峰,本實驗選擇317nm進(jìn)行分析。

采用梯度洗脫對二硝托胺和ANOT進(jìn)行同時分析時,初始流動相中有機相比例大于25%時,ANOT和二硝托胺出峰太快,易受雜質(zhì)干擾;而有機相比例低于15%時,ANOT由于出峰較遲而易受雜質(zhì)干擾。本實驗將初始流動相中水相和有機相的比例定為82。從圖2 知,二硝   ANOT    較好,在空白組織中未見干擾。

32提取和凈化條件的選擇

二硝托胺和ANOT極性較強,且易溶于酸性溶液,本實驗采用磷酸鹽緩沖液pH(4,5,67)提取雞肌肉和雞肝樣品(3)。當(dāng)pH=60時,肌肉樣品中二硝托胺和ANOT的提取回收率均高于90%;于肝臟樣品,pH=4070時,提取效果越來越差,僅pH40時,二硝托胺和ANOT的提取回收率高于90%。因此,提取樣品時,肌肉和肝臟樣品分別采用pH60pH40的磷酸鹽緩沖液。

而對實驗發(fā)現(xiàn),雞肉提取液直接進(jìn)行固相萃取凈化時,ANOT的回收率僅約40%,且HLB小柱換成BondElutC18小柱后,回收率無明顯改善。而雞肉提取液調(diào)至pH70后進(jìn)行實驗,過HLB小柱,回收率大于90%;BondElutC18柱,回收率無明顯改善。本實驗采用HLB小柱進(jìn)行凈化。

33線性實驗

稱取二硝托胺和ANOT標(biāo)準(zhǔn)品各100mg100mL容量瓶中,用乙腈定容,得100mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。用01%甲酸-乙腈(8020,V/V)稀釋,配制20,100,200,500,10002000!g/L系列標(biāo)準(zhǔn)工作液,進(jìn)行LC分析,每個濃度進(jìn)樣3次,以標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。實驗結(jié)果表明,二硝托胺和ANOT的線性范圍為202000!g/L,標(biāo)準(zhǔn)曲線方程分別為y=2066x10497(ANOT)y=2115x17878(二硝托胺,相關(guān)系數(shù)(r)均高于09998。本方法適用于二硝托胺和ANOT的定量分析。

34方法的檢出限、回收率和精密度

采用在空白樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)溶液的方法,對雞肉和雞肝樣品進(jìn)行了3次添加回收實驗,每個濃度點重復(fù)進(jìn) 6次,結(jié)   1。雞肉和雞肝中各濃度點二硝托胺和ANOT的平均添加回收率均在792%881%之間。批內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均在27%52%之間,批間RSD均在41%69%之間,方法具有較好的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。同時按信噪比S/N=31計算得兩種組織中的檢出限為550!g/kg(ANOT)250!g/kg(二硝托胺)

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

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